Музейна колекція культових речей починалась із створення в музеї 1905 р. відділу – “церковна старовина”. Отримавши від Синоду дозвіл на обстеження церков Катеринославської єпархії на предмет виявлення і рятування старовинних церковних книг, ікон, літургійного одягу та іншого церковного начиння, Д.І.Яворницький вже у перший рік своїх мандрівок по сільських церквах губернії знайшов і перевіз до музею 600 різноманітних старовинних церковних речей.
Євангелія з вкладними написами, Біблії ХVI-ХVIII ст., рідкісні ікони, вишукано оздоблені фелоні, єпітрахілі, плащаниці, воздухи, срібні та кипарисові напрестольні хрести, вінці, чаші, вилучені Д.Яворницьким з церков як пам’ятки старовини, були врятовані ним від пошкодження, подальшого псування, а інколи й недбалості місцевих священнослужителів тощо. В той же же час катеринославські колекціонери (зокрема В.Д.Машуков, П.Ф.Пронін, В.Я.Левенсон и др.) передавали до музею культові речі з приватних колекцій, в тому числі придбані за кордоном: в Західній Європі, країнах Близького Сходу, Китаю)
В колекції музею зберігаються пам’ятки, що відображають первісні релігійні вірування місцевого населення від палеоліту до Київської Русі; східні (Китай, Монголія, Індія), античні грецькі, єгипетські міфологічні та релігійні уявлення; діяльність православних, католицьких, протестантських, іудейських, ісламських конфесій та громад, сучасних релігійних та культових об’єднань, що існували і продовжують існувати серед населення краю.
Сьогодні в культова колекція музею нараховує 7000 музейних предметів. Серед них:
- російські та українські ікони на дереві, релігійний живопис на полотні (ХVIII-поч.ХХ ст.);
- витвори декоративно-прикладного мистецтва, серед яких предмети дрібної церковної пластики з металу, дерева та мушлів (ХIX-поч.ХХ ст.); церковне начиння, виконане у різноманітних техніках (ХVIII-ХIХ ст.); літургійне шитво (ХVIII-поч.ХХ ст.);
- християнські літературні пам’ятники: богослужебні рукописні та друковані кириличні видання (Біблія, Євангелія) (ХVI-ХVIII ст.);
- іудейська література (Тора), ритуальні світильники, посуд і тканини; елементи художнього оформлення Тори (ХVIII-ХХ ст.), серед них високохудожні завіси на Тору і срібні вістря на сувій Тори;
- китайські і монгольські статуетки та ікони з зображенням персонажів буддійського пантеону і фрагменти зібрання канонічних текстів буддизму, статуетки із зображенням божеств і святих даосського пантеону і китайських народних вірувань;
- фото і архівні матеріали, що відображають історію церков і творчу спадщину видатних релігійних філософів та діячів церкви Нікіфор (Феотокі); Феодосій Макаревскьий, Гавіїл (Розанов), Агапіт (Вишневський); Леві-Іцхак Шнеєрсон, Олена Блаватська.
